ترارساني علامت هورمون اكسين

(Auxin Signaling)

فرآيندهای بسیاری در عرض چند دقيقه پس از به كار بردن هورمون گیاهی اكسين بر روي بافت گياهي رخ مي دهد. اين اثرات باعث تغييرات سريع در فعاليت هاي انزيمي و بيان ژن و تغيير در فعاليت ناقلين مي شود كه نهايتا منجر به اسيدي شدن ديواره سلولي، افزايش سريع در پتانسيل غشايي يا ميزان كلسيم سيتوسولي مي شود. سوال اساسي در زيست شناسي اكسين اين بوده است كه چطور چنين مولكول ساده اي اين صف مختلف و متناوب پاسخ ها را كنترل مي كند. بيشتر اين پاسخ هاي اوليه مسير ترارساني علامت هنوز ناشناخته است.

ژن هاي پاسخ دهنده به اكسين

رويدادهاي مولكولي اوليه براي روشن كردن عمل اكسين مشخص کرده است كه هورمون تغييرات خاص و سريعي را در ارتباط با بيان ژن القا مي كند و در اين راستا چندين ژن پاسخ دهنده به اكسين شناسايي شد. از جمله بيشترين موارد مشخص شده 3 خانواده ژني SAURs و GH3s و AUX/IAA هستند كه به سرعت در پاسخ به اكسين تحريك شدند.
(SAURs) SMALL AUXIN-UP RNAs ، در ابتدا در soy bean شناسايي شد به طوريكه پس از تيمار كمي از اكسين تجمع سريع رونوشت ها را در پي داشت. ژنهاي SAUR در بسياري ديگر از گياهان شناسايي شده است، مانند آرابيدوبسيس چند تا از رونوشت هاي SAUR به علت عناصر پايين حفظ شده در نواحي ترجمه نشونده 3 يافت شده conserved downstream element (DST) بسيار ناپايدار هستند. اين رونوشت ها پروتئين هاي كوچك 9-15 KD را كد مي كنند، آناليز توالي آن، سرنخ هاي كمي از عمل آنها را حاصل كرد. در ذرت zmSAUR2 يكسري پروتئين هايي هسته اي با عمر كوتاه را نشان داده اند و هم zmSAUR2 و zmSAUR1 در شرايط آزمايشگاهي به صورت متصل به كالمودولين يافت شده اند. اينكه SAUR ها چه نقشي در ترارساني علامت اكسين داشته باشد نامعلوم باقي مانده است.
آرابيدوبسيس حاوي 19 ژن GH3 مي باشد، چند تا از انها توسط اكسين تحريك مي شوند. يافته هاي اخير نشان مي دهد كه برخي از اعضا خانواده GH3 يك كلاس از آنزيم هاي acyl-adenylate-forming را كه مي توانند به عنوان IAA- آمينوسنتاز در مورد IAA هاي متصل به آمينو اسيد عمل كند را پيشنهاد مي كند كه تحريك ژنهاي GH3 توسط اكسين به عنوان مكانيزم پس خوردي مي باشد كه سيگنال اكسين را توسط غير فعال كردن IAA از طريق اتصال ، كاهش مي دهد. در جوانه هاي آرابيدوبسيس بيان زيادي GH3.6 براي مقاومت به IAA نشان داده شده، جوانه هاي حاوي جهش هاي حاوي GH3.5 يا GH3.17 افزايش حساسيت را نشان دادند. بايد توجه شود كه همه ژنهاي GH3 تحريك شونده با اكسين نيستند، يا اينكه همه پروتئين هاي GH3 فعاليت IAA- آمينو سنتازي ندارند.
براي مثال GH3.11/JAR1 از طريق رونويسي توسط اكسين تنظيم نشد و در عوض عمل آن به عنوان يك جاسمونيك اسيد-آمينوسنتاز نشان داده شده است.
ژنهاي AUXIN/INDOLE-3-AGETIC ACID.سومين كلاس بزرگ رونوشت هاي تحريك شونده با اكسين را در بر مي گيرد. در ابتدا ژن هاي AUX/IAA در سويا و نخود شناسايي شد و بعدا در بسيار ديگري از گياهان شناسايي شد، مثلا آرابيدوبسيس حاوي يك خانواده ژني 29 عضوي است. همانطور كه در مورد ژنهاي SAUR تحريك شونده با اكسين گفته شد، تحريك AUX/IAA پي از چند دقيقه تيمار با اكسين بدون نياز به سنتز پروتئين جديدي اتفاق مي افتد. ميزان توسعه تحريك به اندازه بيان سينتيكي به طور قابل ملاحظه اي بين اعضاي خانواده AUX/IAA متغيير است. ژنهاي AUX/IAA پروتئين هاي 20-35 كيلودالتوني راكد مي كنند كه در تمام موارد مورد ازمايش تا به اكنون نشان داده شده است كه در هسته قرار مي گيرند.
چندين خط ژنتيكي و شواهد مولكولي بيان مي كند كه عمل اين پروتئين ها در پاسخ به اكسين عمل فاكتورهاي رونويسي را مهار مي كند. به استثنا كمي ، پروتئين هاي AUX/IAA چهار موتيف بسيار حفظ شده به نام دومين Iν,III,II,I دارد.
دومين III پايانه C و دومين IV با ديگر پروتئين هاي AUX/IAA و فاكتورهاي پاسخ دهنده به اكسين(ARFs) ديمر مي شوند كه آنها نيز اين دوموتيف را دارند. دومين I به عنوان موتيف مهار كننده رونويسي عمل مي كند ، دومين II در پايداري پروتئين AUX/IAA نقش داشته كه يك degron را تشكيل مي دهد كه پروتئين AUX/IAA قابل تجزيه توسط مسير پروتئوليتيك پرتئازوم يوبي كوئيتين s26 واين توالي توسط اين مسير تجزيه اي هدف گيري مي شود. عمل اين موتيف بسيار حفظ شده است و نقش پروتئين هاي AUX/IAA در پاسخ به اكسين با جزئيات بيشتر مورد بررسي قرار مي گيرد.

فاكتورهاي پاسخ دهنده به اكسين

نواحي تنظيمي بالا دست چندين ژن پاسخ دهنده به اكسين حاوي چندين كپي از توالي هاي حفظ شده TGTCTC مي باشد. اين توالي به عنوان عناصر پاسخ دهنده به اكسين AUXRE شناخته شده است. شناسايي توالي AUXRE باعث جداسازي ژن ARF1 در آرابيدوبسيس شد. و نهايتا، مطالعات مولكولي، ژنتيكي منجر به شناسايي 23 ژن ARF در آرابيدوبسيس شد. پروتئين هاي ARF در پايانه N خود دومين حفظ شده اي دارند كه متصل شوند به DNA است و اتصال به توالي AUXRE را تنظيم مي كند. اكسين روي اتصال ARF به DNA تاثيري نداشت.
ARF ها در حالت عمومي حاوي 3 دومين شناخته شده اند: دومين متصل شونده به DNA (DBD) كه به AUXRE متصل مي شود، يك دومين ميان و دومين سومي كه براي تنظيم همو يا مترو دايمر شدن يافت شده است. اينكه ARF ها مهار كننده يا فعال كننده باشند بسته به ساختار دومين مياني آن است. براي مثال ARFs ها با ناحيه مياني Q-Rich رونويسي را فعال مي كند، در حاليكه ARFs ها با ناحيه ميانيS-Rich رونويسي را مهار مي كند.
برهمكنش بين AUX/IAA و ARF ها باعث مهار بيان ژنهاي تحريك شونده با ARF مي شود و اين مهار روي ARF زمانيكه پروتئين AUX/IAA تجزيه شود برداشته خواهد شد. در اين مورد از جهش هاي با تقويت عملكرد پروتئين هاي AUX/IAA استفاده كردند، كه باعث غير حساس شدن به اكسين شد. بسياري از پروتئين هاي AUX/IAA عمر كوتاهي دارند و جهش هاي با تقويت عملكرد در ژن هاي AUX/IAA با تغيير امينو اسيد خاصي در دومين II كه پايدار كننده است را به وجود مي اورد و بنابراين پاسخ به اكسين مهار شده باعث ايجاد فتوتيپ غير حساس به اكسين مي شود. اكثر پروتئين هاي ARF همچنين حاوي ناحيه ديمر شونده پايانه C است كه بسيار وابسته به موتيف II و IV پروتئين هاي AUX/IAA مي باشد.(ميل تركيبي بالا). اين دومين پايانه C ، تشكيل هموديمر بين پروتئين هاي ARF را به خوبي تشكيل هتروديمر شدن با پروتئين هاي AUX/IAA را تنظيم مي كند.
در آزمايش بررسي اتصال DNA با تكرارهاي AUXRE پاليندرومي پيشنهاد كرد كه ديمر شدن ARF-ARF ممكن است اتصال اين فاكتورهاي نسخه برداري را به محل هدفشان آسانتر كند، اما اخيرا با سنجش هاي بيشتر با به كار بردن ARF هاي بدون عناصر ديمر شونده C ترمينال نشان داد كه، ديمر شدن ARF براي اتصال به AUXRE ضروري نيست.
در اين مورد فعالسازي ARF ها با ديمر شدن با پروتئين هاي AUX/IAA ، كنترل هورموني فعاليت رونويسي ARF را بوجود مي اورد. چندين عضو از خانواده AUX/IAA مي تواند با ARFهاي Q-Rich برهمكنش داشته باشد و فعاليت رونويسي را مهار كند.
اخيرا نشان داده شده كه دومينI در AUX/IAA مي تواند به عنوان مهار كننده رونويسي عمل كند كه ممكن است مسئول تنظيم منفي باشد، در پاسخ به تحريك اكسين ، پروتئين هاي AUX/IAA توسط پروتئوزوم s26 مهار مي شود. كاهش در مقدار پروتئين AUX/IAA مهار روي ARF Q-Rich را فرو مي نشاند، در نتيجه افزايش رونويسي از ژنهاي پاسخ دهنده به اكسين را داريم.(مكانيزم بيشتر توضيح داده خواهد شد.)
سازگار با اين مدل، جهش هايي با عمل اكتسابي غالب در چندين ژن AUX/IAA جدا شده اند. كه به آنها فتوتيپ هاي وابسته به اكسين افزايش مي دهد و پاسخ به اكسين را كاهش مي دهد.
مطالعات مولكولي نشان داده شده است كه همه اين جهش ها توالي دومينII را هدف مي گيرند و باعث افزايش چشمگيري در پايداري مهار كننده جهش يافته AUX/IAA مي شوند. بررسي چندين جهش يافته ARF از آرابيدوبسيس ديدگاهي در مراحل مختلف مربوط به اكسين در مورد تنظيم اين فاكتورهاي رونويسي را به وجود اورد.
جهش درETTIN/ARF3 S-Rich ARF غير معمول را باعث مي شود كه موتيف هاي ديمر شونده پايانه C را ندارد، نقص مشابهي در الگو gynocium با گل هايي كه انتقال اكسين در آنها توسط تيمار با بازدارنده NPA مشاهده شد. اتيلن و نور به عنوان HLS1 براي تنظيم مقدار پروتئين S-Rich ARF براي كنترل طويل شدن تمايزي سلول در هيپوكوتيل عمل مي كند. جهش يافته هاي arf2 چندين فتوتيپ مثل افزايش اندازه در چندين ارگان، ساقه هاي بدون گراويت تروپيسم agravitropic و پيري و ريزش تاخير يافته را نشان دادند، بررسي هاي microarray با استفاده از RNA از جوانه هاي هفت روزه arf2 تهيه شد كه هيچ نوع تغيير در بيان ژنهاي تنظيم شونده با اكسين را نشان نداد. شواهد اخير در حمايت اين ، در مورد جهش يافته هاي دوتايي arf1 arf10 ، به علت تمايز سلولي راس ريشه نا به جا را به صورت رشد ريشه اي agravitropic نشان داد. در مورد ض Q-Rich ARFs ، جهش در monoPTEROUS (MPIARF5) نقايصي در الگو جنيني با چندين آلل بدون ساختارهاي پايه اي را به وجود آورد. در مقابل، جهش در (NPH4/ARF5)NON-PHOTOTROPIC HYPOCTYL4 بعلت كاهش توسعه سلولي در پاسخ به اكسين باعث كاهش پاسخ تروپيك در بخش رويشي شد. فتوتيپ هاي جهش يافته هاي nph4 و mp نشان مي دهد كه اين 2 ARF پاسخ شاخص به اكسين را تنظيم مي كنند. نتايج اخير جهش هاي nph4 فتوتيپ افزايش بي ريشه بودن آلل هاي ضعيف mp را به وجود آورد پيشنهاد مي دهد كه برخي عملكردها بين اين دو فاكتور فعال كننده رونويسي با هم همپوشاني دارد. ARF19 نيز به طور زيادي همراه با ARF7 براي عمل خود ظاهر مي شود جهش يافته هاي arf19 هيچ فتوتيپ ظاهري را نشان نمي دهد، arf19 نقايص تروپيك حاصل از nph4 را افزايش مي دهد و جهش يافته هاي دوتايي فتوتيپ هاي وابسته به اكسين شديدتري را مثل مقاومت طويل شدن ريشه وابسته به اكسين و كاهش در توسعه برگي و نمو ريشه هاي جانبي را نشان مي دهد.
جهش يافته هاي arf8 ، افزايش غالبيت راسي ، ازدياد ريشه هاي جانبي و افزايش هيپوكوتيل را در نور نشان دادند. اين قبيل فتوتيپ ها ي وابسته به اكسين مشخصه جهش يافته هايي با توليد اضافي و زياد IAA مثل yucca،sur2 هستند و در نگاه اول متناقض با اين مسئله كهARF8 يك فعال كننده رونويسي ژنهاي پاسخ دهنده به اكسين مي باشد ظاهر مي شوند. بررسي هاي بيشتر نشان داد بيان چندين ژن GH3، كد كننده آنزيم هاي متصل به IAA باعث كاهش اثر جهش يافته هاي arf8 مي شود، با اين حال بيان ARF8 در گياهان به مقدار زيادي بالا رفت. اين اطلاعات پيشنهاد مي كند كه ARF8 ممكن است در مسير پس خوردي منفي براي كنترلIAA از طريق فعالسازي بيان GH3 نقش داشته باشد و يك ارتباط نزديك بين ترارساني علامت اكسين و هموتسازي اكسين را پيشنهاد مي كند(تعادل حياتي). همچنين بررسي جهش يافته هاي ARF و AUX/IAA پيشنهاد مي كند كه عمل مهمتر و بيشتري بين هر يك از اعضاي خانواده ژني مربوطه وجود دارد، در حقيقت چندين جهش يافته arf نقايض ويژه اي در رابطه با اكسين نشان مي دهد كه نشان دهنده تخصص يافتگي عملكرد انها مي باشد. همچنين، فتوتيپ موتان هاي با عمل اكتسابي غالب AUX/IAA متغيير بودن و تخصص يافتگي بسيار زيادي را نشان داده است. تمامي پروتئين هاي ARF به يك توالي تنظيمي عمومي AUXRE متصل مي شوند. بعلاوه ، پروتئين هاي AUX/IAA براي بر همكنش با كمترين ميزان ARF هاي فعال كننده ، تخصص يافتگي خاصي را نشان نمي دهند. براي مثال، چندين پروتئين AUX/IAA به صورت يكساني، ARF7، ARF5 ، تنظيم كننده فعاليت رونويسي از يك ساختار گزارشگر reporter construct ، زمانيكه همزمان در پروتوپلاستهاي هويج بيان مي شوند را مهار مي كند. اين سوالي ايجاد مي شود كه چه طور پاسخ هاي خاص مر بوط به اكسين بوجود مي آيد؟
كارهاي اخير پيشنهاد مي كند كه اين تخصص يافتگي ممكن است در بخش بزرگي توسط الگوهاي بيان شده از هر دو پروتئين هاي ARF و AUX/IAA حاصل شده باشد.
جهش يافته هاي با عمل اكتسابي غالب در ژن هاي AUX/IAA (BDL/IAA12) باعث نقايص نموي جنين مي شود كه همانند با عملكرد حذف شده در MP/ARF5 مي باشد كه پيشنهاد مي كند BDL فعاليت MP را تنظيم مي كند.
در مقابل، جهش هاي هم ارز در دومينSHYz/IAA3 فتوتيپ كوتاهي هيپوكوتيل را ايجاد كرد، اما روي جنين زايي تاثيري نداشت كه اين پيشنهاد مي كند كه ARF مشخص را تنظيم مي كند. Weijers و همكارانش؛ راهبرد جانشيني براي مشخص كردن اينكه ايا تنظيم رونويسي تمايزي از اين دو ژنAUX/IAA در فتوتيپ هاي جهش يافته ها مشخصي شركت مي كنند يا نه، استفاده كردند. به طور قابل ملاحظه اي ، جوانه هاي ترانس ژنيك بيان كننده الل غالب shy2-2 از پروموتور BDL فتوتيپ جنيني كه از نظر كيفيت همسان با موتان هاي bdl بودند را نشان دادند. متقابلا، طويل شدن هيپوكوتيل و نمو بخش رويشي در گياهانpsHY2=bdl به طور برجسته اي با جهش يافته هاي shy2-2 مشابه بود. اين يافته ها پيشنهاد مي كند پروتئين هاي SHY2 ،BDL از نظر عملكردي براي پاسخ خاص به اكسين يكسان هستند و كنترل بيان رونويسي از AUX/IAA مهمترين تعيين كننده براي هدايت هستند به طوريكه پاسخ ها به اكسين به وسيله اعضاي خاصي از خانواده AUX/IAA تنظيم مي شود. بايستي توجه شود كه شواهد قوي براي تخصص يافتگي عمل پروتئين هاي AUX/IAA يافت شده است. در حاليكه ترانس ژنهاي psHY2=bdl عمل phenocopy فتوتيپ هاي بخش رويشي از گياهان shy2-2 را داشته، و فتوتيپ هاي agrovitropic رشد ريشه اي كه مشخصه جوانه هاي shy2-2 مي باشد در ترانس ژنها ديده نشد، البته مطالعات بيشتر نياز است، بدون شك تنظيم بيان اعضا خانواده AUX/IAA و ARF نقش مهمي در تعيين اين تخصص يافتگي بازي مي كند. مطالعات اخير پيشنهاد مي كند كه كنترل پس از رونويسي در بيان ARF نيز در تعيين الگوهاي بيان دخالت مي كند.microRNA ها(mi RNAS ) و trans-actiny short-interfiering RNA ها tasi-RNAS) ) مي تواند با ايجاد شكستگي (برش) چندين رونوشتARF را بو وجود اورد. براي مثال، ARF16 ARF10 miRNA miR160 و رونوشت ARF17 را هدف گيري مي كند. بيان زياد miR160 نقايص راس ريشه اي مشابه با موتان هاي arf16 arf10 را به وجود اورد، در حاليكه بيان فرم هاي مقاوم به شكستگي از ARF16 يا ARF17 تعدادي نقايص وابسته به اكسين نشان مي دهد كه نشان دهنده نقش حياتي miRNAS در محدود كردن دومين بيان كننده ARF مي باشد.

تنظيم پاسخ اكسين توسط SCF TIR1 ubiquitin-ligase

شناسايي ژنتيكي و بررسي جهش يافته هاي مقاوم به اكسين در ارابيدوبسيس توضيحات پربهائي را در مورد مكانيزم مولكولي تحت عمل اكسين اثبات كرده است. مطالعلت مولكولي و بيوشيميايي تحت تاثير محصولات ژني توسط اين جهش يافته ها، كمپلكس SCF TIR1 ubiquitin-ligase به عنوان تنظيم كننده را در مركز ترارساني علامت اكسين قرار داده است. ubiquitin-ligaseيا انزيم هاي E3، تصال به پروتئين هاي سوبترا را كاناليز مي كند. يوبي كوئيتيني شدن اين سوبترا ها را براي پروتئوليز توسط پروتئازوم 26S نشان دار مي كند. نوع . SCF ubiquitin-ligaseشامل خانواده بزرگ انزيم هاي E3 در ارابيدوبسيس مي باشد.
اين انزيم هاي چند زير واحدي شامل SKP1 ، cullin1 و يك پروتئين Fbox و يك حلقه كوچك، دومين پروتئيني Rbx1/Roc1/Hrt1 مي باشد. Cul1 به عنوان يك پروتئين ساختماني عمل مي كندريال RBX1 از طريق دومين C-terminal ، SKP1 از طريق دومين پايانهN متصل مي باشند. پروتئين هاي F-box به هسته هتروترميك از طريق بر همكنش بين دومين F-box و پروتئين SKP1متصل مي شوند و به عنوان زير واحد تنظيمي قابل تغيير مي باشد كه سوبستراهاي تازه به كمپلكس SCF براي يوبي كوئيتيني شدن از طريق آن متصل مي شوند. TIR1 يكي از حدود 700 پروتئين F-box كد شده در ژنوم ارابيدوبسيس مي باشد. جهش در TIR1 نقص پاسخ به اكسين شامل مقاومت در رشد ريشه در اثر كاهش در نمو ريشه جانبي مي شود، مطالعات مولكولي تاثير كرد كه TIR1 به عنوان پروتئين F-box مي باشد. جهش در AXR6 (Auxin Resistant6) ژن كد كننده زير واحد cul1 در نمايه هاي مقاوم به اكسين نيز جدا شده است و يافته هاي ژنتيكي معكوس براي نشان دادن اينكه ژنهاي (Arabidopsis sKp1-like1)ASK1 و RBX1 نيز براي پاسخ به اكسين مورد نياز است، استفاده شد. برخلاف جهش ها در TIR1، جهش يا ترانس ژنهايي كه هسته زير واحدهاي SCF به صورت خاصي بر ترارساني علامت اكسين اثر ندارد. اين يافته ها ثابت كرد كه كمپلكس SCF TIR1 يوبي كوئيتين-ليگاز به عنوان يك تنظيم كننده مثبت براي پاسخ به اكسين است و به عنوان مدلي شامل اينكه SCF TIR1- يوبي كوئيتين-ليگاز باعث يوبي كوئيتينه شدن مهار كننده ترار ساني علامت اكسين پيشنهاد شده است. جداسازي ژنتيكي چندين ژن AUX/IAA با افزايش عمل الل هاي ان، در نماهاي مقاوم به اكسين دلالت بر اين داشت كه پروتئين AUX/IAA به عنوان مهار كننده پاسخ به اكسين مي باشد.(تصوير1)
بررسي هاي مولكولي نشان داد كه تمام اين آسيب ها بارز،آمينو اسيدهاي بسيار حفظ شده اي در دومين II در AUX/IAA تحت تاثير قرار داده است. مطالعات ابتدايي روي پروتئين هاي AUX/IAA نشان داد كه اين پروتئين ها بسيار ناپايدار بودند. اين ناپايداري ناشي از دومين II است كه به عنوان degron عمل مي كند، پروتئين هاي AUX/IAA براي يوبي كوئيتيني شدن توسط كمپلكس SCF TIR1 در پاسخ به تحريكات اكسين از طريق اين دومين نشانه گذاري مي شود. اين به صورت ظريفي استفاده از يافته هاي مولكولي، ژنتيكي و بيوشيميايي را همراه با هم نشان داد. اولا، دومين II باعث ناپايداري تنظيم شونده با اكسين براي پروتئين هاي متصل شونده luciferase و B-glucuronidase در شرايط ازمايشگاهي مي شود. اين اتصال نيازمند دومين II است و توسط جهش هايي كه باعث عمل بالاي AUX/IAA مي شود از بين مي رود. سوما، جهش يافته هايي كه كمپلكس SCF TIR1 را تحت تاثير قرار مي دهد، باعث پايداري داخلي پروتئين هاي AUX/IAA شده، همان طور كه دومين II متصل به پروتئين هاي گزارش گر در شرايط ازمايشگاهي نشان داده بود. اين ها و ديگر يافته پيشنهاد مي كند كه اين پاسخ به تحريك اكسين، پروتئين هاي AUX/IAA براي كمپلكس SCF TIR1 به كار برده شد و يوبي كوئيتينه شد.
سپس از هم پاشيدن AUX/IAA توسط پروتئازوم 26S مهار فاكتورهاي رونويسي ARF را بر مي دارد، بنابراين رونويسي وابسته به اكسين را قادر به تغيير مي سازد. از انجائيكه جهش در دومين II باعث مي شود توسط TIR1 شناسايي شود، باعث مهار كنندگي AUX/IAA مصون در مقابل پرتئوليز شود و باعث مهار فعاليت ARF مي شود. اين طور به نظر مي رسد اكسين پروتئوليز پروتئين AUX/IAA و افزايش رونويسي ژن AUX/IAA را توسعه مي دهد كه اين پاسخ اخري احتمالا يك فيدبك منفي براي ضعيف كردن سيگنال اكسين است كه پاسخ گذارا به اكسين را تامين مي كند.(تصوير2)

تصوير1- مدل SCF Ubiquitin Ligase

تصوير2-تنظيم پاسخ اكسين توسطSCFTIR1 ubuquitin Ligase

(a اتصال مهار كننده AUX/IAA به فاكتورهاي رونويسي و مهار آن
(b پروتئوليز مهار كننده AUX/IAA توسط SCFTIR1 ubuquitin Ligase و در نتيجه فعال شدن رونويسي توسط فاكتور رونويسي

تنظيم فعاليت SCF TIR1

بررسي موتان هاي مقاوم به اكسين اضافي نشان داده است كه چندين تركيب تنظيمي عمل SCF TIR1 را تنظيم مي كند. موتان هاي axr1 نقض شديد در پاسخ به اكسين را نشان دادند. AXR1 پروتئين وابسته به بخش نيمه انتهايي آميني از آنزيم فعال شونده با يوبي كوئيتين را كد مي كند و مطالعات بيوشيميايي بر همكنش AXR1 را با پروتئين هاي (ECR1) وابسته به آنزيم هاي متصل شونده كه با آنزيم مرتبط به يوبي كوئيتين ،(RUB) كمپلكس تشكيل مي دهند را نشان مي دهد.
( Related ubiquitin activating enzyme)
آرابيدوبسيس 3 تا پروتئين RUB (كه در پستانداران به عنوان NEDD8 شناخته شده) با حدود 60% توالي مشترك با يوبي كوئيتين راكد مي كند. فعال كننده، RUB به RCE1 (آنزيم متصل شونده به RUB1 انتقال داده شد، كه RBX1 را به عنوان RUBE3 ليگاز استفاده مي كند و اضافه كردن RUB را به باقي مانده ليزين نزديك C ترمينال زير واحد CUL1 از كمپلكس SCF TIR1 كاتاليز مي كند.
بي شباهت به يوبي كوئيتين ، اتصال به RUB باعث پروتئوليز گوهرمايه نمي شود، اما ترجيحا باعث تنظيم تغيير پذير مورد نياز براي فعاليت SCF-ubiquitin-Ligase مي باشد، همانطور كه توسط يافته نشان دادند، پايداري AUX/IAA در مسير RUB در جهش يافته ها افزايش مي يابد.
جداسازي RUB از CUL1 يك فرايند ديناميك است. SCF با
(CSN)COP9 singlasome، يك كمپلكس با 8 زير واحد شبيه به Proteasomelid 26s برهمكنش دارد. CSN فعاليت ايزوپپتيدازي دارد كه RUB را از CUL1 جدا مي كند. به طور شگفت آوري ، گياهاني كه عمل CSN انها خراب شده پاسخ به اكسين كمتري را نشان دادند و پايداري AUX/IAA افزايش يافته اي را نشان مي دهد ،البته مانند اتصال RUB ، جدا شدن RUB از CUL1 نيز براي فعاليت بهينه SCF TIR1 مورد نياز است.
همچنين سازگار با توجه به اينكه جدا شدن RUB نقش مهمي را در عمل SCF دارد، گياهاني كه بيان بيان بيش از حد RBX1 دارند يك تبديل و تغيير زياد از CUL1 را نشان دادند، باز هم با اينحال چندين پاسخ به اكسين دچار نقض شد و
فعاليت SCF TIR1 كاهش يافت.
عملكرد مولكولي تغيير و تبديل RUB نامشخص است. سنجش هاي بيوشيميايي پيشنهاد مي كند كه اتصال و جدا شدن RUB از CUL1 ممكن است فعاليت SCF در شرايط ازمايشگاه را با آسان كردن برهمكنش با آنزيم هاي E2 بارگذاري شده توسط يوبي كوئيتين افزايش دهد. احتمال بيشتر با شناسايي
CULLIN ASSOCIATED AND NEDD8 DISSOCIATED1(CAND1) پديدار شده است. مطالعات بيوشيميايي در مورد CUL1 انساني CAND1 به عنوان پروتئين متصل شونده به CUL1 شناسايي شد. CAND1 به صورت مخصوصي با Culin غير اصلاح شده(غير تنظيمي) برهمكنش دارد و مي تواند با تغيير تبديل CUL1 توسطRUB در شرايط ازمايشگاهي جدا شود.
بعلاوه، اتصال CAND1 و SKP1 به CUL1 متقابلا انحصاري است، كه پيشنهاد كننده مدلي است كه به موجب آن CAND1 از كم شدن منبع CUL1 جلوگيري مي كند، بنابراين يك تنظيم منفي فعاليت ubiquitin-Ligase با جلوگيري از گرد آمدن كمپلكس SCF مي باشد.
مطالعات ژنتيكي موتان هاي cand1 آرابيدوبسيس، طرح پيچيده تري را پيشنهاد مي كند. افزايش فعاليت SCF TIR1 بيشتر مورد انتظار بود. موتان cand1 در پروتئوليز AUX/IAA ناتوان بودند و پاسخ به اكسين همانند موتان هاي SCF كاهش دادند. براي تطبيق اين مشاهدات، پيشنهاد داده شد كه مسير RUB، CAND1 وCSN در شرايط آزمايشگاهي ،با افزايش چرخه گردايش و واپاشي SCF، فعاليت SCF را پايدار مي كند .(تصوير 3)
همچنين اين چنين چرخه اي براي فعاليت SCF در شرايط آزمايشگاهي سنجش يوبي كوئيتيني شدن نياز نيست، اين ممكن است در يك زمينه سلولي كه مقدار زيادي پروتئين F-box براي دست يابي به زير واحد هاي مركزي رقابت مي كند ضروري باشد. هر چند كه مطالعات بيشتري براي آزمايش اين مدل لازم است.
اين واضح است كه CAND1، CSN و مسير RUB به صورت تنگاتنگي به هم ارتباط دارند و براي عمل طبيعي SCF TIR1 لازم مي باشند. SGT1b نيز كه با كمپلكس SCF بر همكنش دارد براي فعاليت SCF TIR1 در شرايط آزمايشگاهي لازم است همچنين پيشنهاد شده است كه گردايش SCF را به صورت بالقوه تنظيم مي كند.(تصوير4)

تصوير3-تنظيم فعاليت SCFTIR1 از طريق تجمع و تفكيك زير واحدها توسط مدل چرخه اي ،اتصال و جداسازي RUB به CUL1








تصوير 4-ترارساني علامت در آرابيدربسيس تاليانا توسط تخريب پروتئين AUX/IAA تنظيم ميشود كه ازطريق يوبي كوئيتين ليگاز E3 SCFTIR1 انجام ميگيرد.

شناسايي گيرنده هاي اكسين

تمركز براي درك اساس مولكولي فعاليت اكسين روشن سازي اين مطلب میباشد كه چطور اكسين درك و دريافت مي شود. مطالعات كلاسيك، مكان هاي در غشا پلاسمايي و درون سلولي براي درك اكسين را تائيد مي كند. براساس تلاش هاي بيوشيميايي براي جداسازي گيرنده هاي اكسين (ABP1)Auxin binding proterin1 به عنوان يك پروتئين كه با ميل تركيبي بالا به اكسين هاي فعال بيو لوژيكي متصل مي شود شناخته شد. كه در اصل از كلئوپتيل ذرت جداسازي شد، اين پروتئين 22KDs متعاقبا در بسياري از گونه ها يافت شده است و ظاهرا خاص گياهان مي باشد. توالي پروتئيني ABP1 اطلاعات عملكردي كمي را آشكار مي كند. سازگار با حضور موتيف حفظ شده اندوپلاسميك KDEL در C ترمينال، بيشتر ABP1 در ER واقع شده است. شكستگي كوچك در سطح سلولي و چندي از شواهد بر ABP1 متصل به غشا پلاسمايي نشان دهنده پاسخ هاي اوليه الكترو فيزيولوژيك تنظيم شونده با اكسين مي باشد.
يافته هاي ژنتيكي براي روشن سازي فعاليت ABP1 نشان داد كه بيان بيش از حد آن بسط سلولي تنظيم شونده با اكسين را افزايش مي دهد. بعلاوه، موتان هاي فاقد abp1 آرابيدوبسيس فتوتيپ جنين كشنده زودرس را ارائه مي دهد كه نشان دهنده اين است كه ژن ABP1 ژن ضروري مي باشد.
فعاليت مولكولي ABP1 نامشخص باقي مانده ، و ظاهرا در مسير سيگنال دهي تنظيم شونده در SCF TIR1 دخيل نمي باشد. (شركت نمي كند). اثبات تجربي اينكه ، اكسين ، زمانيكه crude protein lysate متصل مي شود مي تواند اتصال پروتئين هاي AUX/IAA را به كمپلكس SCF TIR1 افزايش داده كه اين نشان مي دهد نقش گيرنده هاي اكسين در اين خلاصه عملكردي بود و همچنين يافته هاي جديدي در مورد شناسايي گيرنده ها فراهم اورد.
مطالعات چندين برهمكنش بين گوهر مايه و پروتئين F-box در مخمر و سيستم جانوري نشان داد كه در واقع هر يك از موارد، گوهر مايه بايستي قبل از اينكه توسط هم ريشه پروتئين F-box شناسايي شود ، به صورت پس ترجمه اي تغيير كرده باشد.
در اين مورد گوهر مايه توسط يك كيناز تحريك شونده با محرك فسفريلي ميشود، همچنين ديگر انواع تغييرات نيز گزارش شده است. با آنكه تنها دومين II لازم نيست، اما براي اتصال القا شده توسط اكسين به TIR1 كافي است، اين فرضيه داده مي شود كه كيناز فعال شونده با اكسين يا آنزيم ديگري دومين II را تغيير داده بنابراين پروتئين هاي AUX/IAA براي يوبيكوئيتيني شدن تنظيم شونده با SCF و سرانجام تخريب آن نشانه گذاري مي كند. دومين II degron داراي باقيمانده ضروري قابل فسفريلي شدن نميباشد و با بررسي هاي MS‌در طي انكوبه كردن پپتيد هاي دومين II با تيمار عصاره حاوي اكسين تغييراتي يافت نشد.
اين احتمالات ديگري را باعث مي شود كه اكسين از طريق TIR1 عمل كرده است. دو گزارش اخير نشان داده است كه پروتئين TIR1 Fbox به عنوان گيرنده از اكسين مي باشد ، نشان داده شده زمانيكه IAA به عصاره آرابيدوبسيس خام اضافه شد كمپلكس SCFTIR1-AUX/IAA خالص سازي شده اين اتصال براي اكسين فعال هم ويژه و هم اشباع شدني است، Kd برآورده شده در محدوده 20-80nm بوده اين تنها پيشنهاد مي كند كه يك گيرنده اكسين با SCFTIR1 در ارتباط است، يافتن اينكه TIR1 در سلولهاي جانوري نيز با پروتئين هاي AUX/IAA تركيب در رفتاري وابسته به اكسين بسيار موثر است.
همانطور كه TIR1 و پروتئين AUX/IAA تنها تركيبات موجود در گياه در آزمايش هستند، به نظر مي رسيد كه يكي از اينها بايد مسئول اتصال به اكسين باشند. بعلاوه ، از آنجائيكه 17آمينو اسيد دومينII مي تواند براي پروتئين AUX/IAA سالم گوهر مايه باشد و پيش تيمار اكسين براي TIR1 ، اما نه از پروتئين AUX/IAA ، همچنين برهمكنش بين TIR1 و AUX/IAA در شرايط ازمايشگاهي بيشتر مي شود،و بنابراين پروتئين TIR1 Fbox به عنوان گيرنده LONG SOUGHT اكسين ظاهر مي شود.
بايد توجه كرد كه اتصال مستقيم IAA به TIR1 خالص سازي شده در نبود پروتئين AUX/IAA بايد اثبات شود. در حقيقت موتان هاي فاقد tir1 پاسخ ضعيف به اكسين و كاهش يافته اي را در مقايسه با axr1 يا موتان هاي AUX/IAA نشان مي دهد كه پيشنهاد كرد كه TIR1 نمي تواند تنها گيرنده باشد.
در واقع، 3 پروتئين
60-70% AFB3 – AFB2 – AFB1 (Auxin signaling Fbox prs)
توالي همسان با TIR1 كه اخيرا براي نمايش اتصال وابسته به اكسين به پروتئين AUX/IAA در شرايط ازمايشي نشان داده شده بود را ارائه مي دهد. همانطور ، معرفي جهش هاي afb در گياهان tir1 باعث كاهش پيش رونده اي در پاسخ به اكسين مي شود و با موتان هاي چهار گانه tir1 afb1 afb2 afb3 به اوج مي رسد و فنوتيپي مشابه به موتان هاي mp و bdl با ارائه جوانه كشنده را نشان مي دهد.
آزمايشاتي با تخريب AUX/IAA با موتان هاي چهارگانه فعاليت اتصال آشكار و نه اشباع شدني به IAA را حاصل كرد، نشان دهنده اين است كه اتصال اكسين وابسته به اين پروتئين هاي Fbox است.البته جزئيات بايد روشن شود.

فسفريلي شدن در ترارساني اكسين

به احتمال زياد نامزد براي گيرنده اكسين متصل به غشا هنوز (ABP1) است ، پروتئيني كه در ER نگه داشته مي شود و تنها به مقدار كم در سطح سلول ظاهر مي شود. چندين مدرك نشان مي دهد كه محل قرار گيري ABP1‌ در سطح سلولي در آبشار سيگنالينگ شركت ميكند كه باعث سرعت TIR1/AFB غير وابسته به بسط سلولي و پاسخ اكتر و فيزيولوژيكي اوليه به اكسين مي شود.(تصوير4)
اطلاعات اخير اين فرضيه را حمايت مي كند كه همچنان بايد اطلاعات بيشتري كسب شود، برخي اوقات رويدادهاي فسفريلي شدن گزارش شده كه اكسين وابسته متصل به ABP1 دخيل در سيگنالينگ نبوده است. براي مثال نشان داده شده است كه پروتئين هاي AUX/IAA توسط فيتوكرم در شرايط آزمايشگاهي فسفريلي شده، كه پيشنهاد مي كند سيگنالهاي نوري روي بيان ژن هاي پاسخ دهنده به اكسين توسط اثر بر پايداري پروتئين AUX/IAA عمل مي كند.
همچنين آبشار MAP كيناز در تنظيم پاسخ به اكسين نشان داده شده است.
ريشه جوانه هاي آرابيدوبسيس كه با اكسين تيمار شده، افزايش فعاليت در MAPK را نشان داد و اين فعالسازي در جهش يافته axr4 مقاوم به اكسين مهار شد. اخيرا نشان داده شده است كه AXR4 توسط تنظيم قرارگيري حاملين مورد قبول جريان اكسين AUX1 در غشا پلاسمايي در تنظيم ورود اكسين شركت مي كند. بنابرايننبود فعاليت MAP كينازي القا شده توسط اكسين در axr4‌ احتمالا نتيجه كاهش جذب اكسين مي باشد.
بعيد نيست كه مسير سيگنالينك MAPK در پاسخ اكسين دخيل باشد.
در حقيقت نشان داده شده است كه MAP3K NPK1 پاسخ به تنش فعال مي كند و بيان ژن هاي القا شده توسط اكسين را مهار مي كند.
نهايتا ،گمان ميرود كه سرين /ترئونين كيناز (PID) PINOID به عنوان تنظيم كننده مسير سيگنالينگ اكسين مي باشد. همچنين اطلاعات اخير فعاليت PID را به تنظيم انتقال قطبي اكسين مربوط كرده است(PAT) ، نقش اين كيناز در مسير سيگنالينگ كيناز مي تواند هنوز استثنا باشد.
در نتيجه جدا از مسير مركزي سيگنالينگ اكسين، رويدادهاي فسفريلي شدن نيز به نظر مي رسد پاسخ هاي به اكسين را تنظيم مي كند و اقلا براي توام كردن با ديگر سيگنالها مثل نور و پاسخ به تنش ها همراه با سيگنالينگ اكسين خدمت مي كند.(تصوير4)

ترارساني علامت هدايت پراكنش اكسين

انتقال جهت دار اكسين شيب هاي پويايي از اكسين را به وجود مي آورد.
مشاهده تروپيسم توسط داروين و آزمايشات توسط زيست شناسان گياهي مانند Thimann،Went نه تنها منجر به شناخت اكسين شد ، بلكه انتقال جهت دار اين هورمون از بافت منبع به محل عمل ان را آشكار كرد.
اندازه گيري انتقال با استفاده از اكسين راديواكتيو نشان دار 2 نوع سيستم انتقال اكسين را نشان داد.
1- انتقال سريع و بدون جهت از طريق فلوئم
2- انتقال آهسته و جهت دار سلول به سلول كه به عنوان انتقال قطبي اكسين(PAT) منصوب مي شود.
انتقال از طريق فلوئم اولين بار توسط Thomos و Morris كشف شد و در هر دو جهت بازي و آكروپتال در حدود 5-20cmlh رخ مي دهد.
اتصال بين انتقال سريع اكسين و انتفال قطبي در آزمايشاتي كه در نخود فرنگي اجرا شد نشان داده شد، كه IAA نشان دار شد، با مواد راديو اكتيود اركه در ابتدا در فلوئم ظاهر شده در زمان دومي مورد توجه در سيستم انتقال قطبي يافت شده بود. در مقابل انتقال اكسين در ميان فلوئم، PAT به IAA آزاد محدود شده يك جهته است و در حركت سلول به سلول رخ نمي دهد. سرعت بسيار آهسته تر است و در حدود 5-20 mm/h برآورده شده.
در گياهان دو لپه انتقال قطبي اكسين به عنوان حركت در مسيرهاي طولاني از راس بخش رويشي به ريشه از طريق كامبيوم آوندي و پارانشيم چوب و آوند چوبي تمايز يافته شناخته شده است. در راه خودش به سمت پائين، انتقال اكسين در عرض سلولهاي آوندي به لايه ي بيروني سلول لازم براي تحريك طويل شدن بخش رويشي مهار جوانه هاي جانبي و شروع پريمورديوم ريشه هاي جانبي مي باشد.
در راس ريشه PAT به سمت بالا دوباره جهت داده مي شود، جريان به صورت بازي پتال از طريق اپيدرم ريشه به سوي منطقه طويل شدن ريشه از مهار كننده هاي انتقال قطبي اكسين مانند 1-N-naphthylphtalamic acid براي نشان دادن اينكه اين انتقال سلول به سلول اكسين نمو گياه را هدايت مي كند نشان داده شده است.
اكسين تنظيم سلولي و بسط سلولي را تحريك مي كند و شيب پوياي اكسين و سازماندهي زياد آن توسط انتقال قطبي تنها پاسخ هاي رشدي تروپيك را هدايت نمي كند، همانطور كه توسط cholodny و went فرض شد، بطوريكه د رالگوي جنين زايي، نگهداري مريسم ريشه و آغاز و موقعيت يابي ريشه هاي جانبي و پريمورديم اندازه هاي هوايي آموزنده مي باشد.
حاملين كه اكسين را به خارج مي برند به عنوان محرك انتقال قطبي اكسين
فرضيه chemiosmotic فرض شده براي مكانيزم انتقال قطبي اكسين در ابتداي دهه 1970s نشان مي دهد كه حاملين بيرون برنده و درون برنده اكسين انتقال قطبي سلول به سلول اكسين شركت مي كنند و قرار گيري نا متقارن فرا سلولي حاملين بيرون برنده ، جهت انتقال را مشخص مي كند.
نامزدهايي براي اين پروتئين ها انتقال دهنده مختلف از طريق خصوصيات جهش يافته هاي مختلف اكسين مربوط به آرابيدوبسيس شناسايي شده است. جهش يافته هاي مقاوم به اكسين aux1 منجر به شناسايي خانواده AUX1/LAX پروتئين هاي غشايي شبيه به پرمئازهايي شد كه احتمالا به عنوان حاملين جريان رو به درون اكسين مي باشند.
اخيرا بيان AUX1 heterologous xenopus qocyte فعاليتش را به عنوان يك انتقال دهنده رو به درون اكسين تاثير كردو بعلاوه ، استفاده از جهش يافته ها منجر به شناسايي پروتئين هاي غشايي خانواده PIN شد.(با استفاده از مهار كننده انتقال اكسين) پروتئين هاي PIN و AUX1توزيع نا متقارن فرا سلولي را نشان مي دهند و مطابق با فرضيه chemiosmotic قرار گيري قطبي پروتئين هاي PIN ، كاملا با آن مرتبط است و در حقيقت براي تعيين جهت انتقال اكسين يافت شد. مطالعات نشان داده است كه انتقال دهنده هاي ABC در انتقال اكسين نقش دارند.

تنظيم كننده هاي انتقال قطبي اكسين




نقش پروتئين هاي PIN به عنوان تركيبات محدود كننده سرعت هدايت انتقال قطبي اكسين به خوبي شرح داده شده است درباره ي عوامل و تنظيم كننده هاي استقرار قطبي اين پروتئين هاي غشايي هنوز زياد شناخته نشده است.
آزمايشات توسط coworkers ، Geldner با استفاده از مهار كننده سعي BrefeldinA‌، ممانعت كننده عبور و مرور آوندي و داروهاي دپليمريزه كننده اسكلت سلولي نشان داد كه در سلولهاي اينترفازي، پروتئين هاي PIN1 بين غشاي پلاسمايي و فضاي اندوزم مانند در رفتاري مستقل از عمل ميكروتوبول ها و وابسته به اكسين مي چرخد. باز چرخش PIN احتمالا بايستي براي باقي ماندن و تغيير آسان، بدون تغييرات سريع در استقرار قطبي PIN‌مهم باشد.
در سلولهاي در حال تقسيم ، نهشت PIN در هر دو محل صفحه سلولي در رفتاري وابسته به ميكروتوبول ها يافت شده است، كه نشان مي دهد، استقرار قطبي پروتئين PIN از طريق توزيع مجدد پس ميتوزي برقرار شده است.
براساس مشاهدات اوليه
(ARF-GEF) ADD-ribosylation Faetor- GDD/Gtpexchaxye coworkers Geldner
EMB30/GNOM به عنوان تركيب حساس به BrefeldinA در عبور و مرور ويزيكولهايPIN1 از فضاي اندوزومال به غشا پلاسمايي شناخته شد. مطابق با اين نقش، جهش يافته هاي emb30/gnom با از دست دادن عمل خود در استقرار مناسب فرا سلولي PIN1 داراي نقض بودند و شبيه به آنهايي كه باعث مهار انتقال قطبي اكسين مي شوند، نقص نموي را نشان مي دهند. همچنين فعاليت EMB30/GNOM و ديگر تركيبات تردد كننده ويزيكولي مثل پروتئين كوچك متصل شونده به
GTP، ADD-ribosylation Faetor1 (ARF1) و پروتئين فعال شونده با SCF/VAN3(ARF-GAP) ARF-GTpase با انتقال قطبي اكسين و تردد ويزيكولي PIN مرتبط بوده اند، مدارك روشني براي اينكه پروتئين ها تعيين كننده قطبيت PIN هستند هنوز در دسترس نيست.

مسيرهاي ترارساني علامت تنظيم كننده انتقال قطبي اكسين

در مقايسه با نقش فرعي كينازها در تنظيم پاسخ ها به اكسين ، چندين كيناز كه همه دخالت مستقيم در كنترل انتقال قطبي اكسين داشت يافت شده است. براي مثال،Dai و همكارانش مداركي تهيه كردند كه PAT با آبشار كينازي تنظيم مي شود، هم بيان زياد و هم كاهش عملكرد MAPKK Bub1/MKK7 باعث ايجاد فنوتيپي شد كه نقش MKK7 به عنوان تنظيم كننده منفي PAT پيشنهاد شد.
بعلاوه، عامل قطبيت PIN سرين/ترئونين پروتئين كيناز (PID) PINOID شناخته شد، به طور مثال فعاليت بيش از حد آستانه (تحريكي) اين كيناز دوباره هدف گيري فرا سلولي PIN از قسمت پائين به بخش بالايي (سمت رو به ريشه) به (سمت رو به بخشي راسي ساقه) را القا مي كند.
PID ‌به عنوان ژن هاي اوليه پاسخ دهنده به اكسين شناخته شده است و بنابراين احتمالا كيناز بخشي از حلقه فيدبك است به طوريكه اكسين جهت انتقال خودش را مطابق با فرضيه مجرا سازي تنظيم مي كند(فرضيه: نقش خود سازماندهي انتقال اكسين در الگويابي بافتي را شرح مي دهد.)
Belowwe نقش PID را به دقت شرح داده ، كه چطور فعاليت ان تنظيم مي شود و اينكه ايا پروتئين كينازها در هدف گيري قطبي PID حاملين جريان رو به خارج اكسين ارتباط نزديكي دارد؟

PINOID كيناز جهت دادن به انتقال قطبي اكسين

اولين اشاره به اينكه PID نقش در انتقال قطبي اكسين دارد از شباهت فنوتيپي بين جهش يافته هاي pinoid و جهش يافته فاقد عملكرد pin1 آمد، هر دو جهش يافته نقض دو لپه را نشان داد و آرايش سوزني شكل را ايجاد كرد.
آزمايشات بعدي نشان داد كه بيان زياد PID باعث ايجاد فنوتيپ مثل رشد بدون گراوي تروپيسم و متلاشي شدن مريستم اصلي ريشه ميشود. متلاشي شدن مريستم ريشه مي تواند توسط بازدارنده PAT،NPA كاهش يابد كه پيشنهاد مي كند پروتئين كيناز PID تنظيم كنندهPAT مي باشد.
اخيرا، نشان داده شده است كه PID فعاليت فراسلولي ازراس به پايين پروتئين هاي PIN را تعيين مي كند. بيان زياد PID در راس ريشه باعث قرارگيري PIN ها در قسمت پايين به سمت محل بالائي سلول موضع يابي دوباره پيدا كند.(4 ،2، PIN1 ). اين نتايج در انتقال اكسين به سمت راس باعث محروم شدن مريستم ريشه از اكسين مي شود و منجر به متلاشي شدن مريستم مي شود. بنابراين مقدار PID ، جهت يابي PAT با تعيين كردن پروتئين هاي PIN مورد هدف فرا سلولي تنظيم ميشود.
چندي از شواهد اشاره بر اين حقيقت دارد كه فسفريلاسون PIN ها براي تنظيم استقرار در سطح سلولي شان مهم مي باشد. تغيير باقيمانده سرين در يكي از لوپهاي PIN2 به گلايسين باعث نقض در قرار گيري PIN2 در غشا پلاسمايي شد.
با شناسايي محل هاي فسفريلاسيون نشان داده شد كه لوپ بزرگ مركزي هيدروفوب
كه چندين پروتئين PIN آرابيدوبسيس تالينا در چندين موقعيت در شرايط ازمايشگاهي فسفريله مي شود.
اخيرا مداركي به دست امده است كه PID ممكن است به عنوان كيناز مسئول فسفريلاسيون پروتئين PIN در لوپ بزرگ هيدروفوب آن باشد.

عمل آنتاگونيستي(رقابتي) PINOIDو پروتئين فسفاتاز 2A ، هدف گيري قطبي PIN را تنظيم مي كند

در جهش يافته اي، يك ژن كد كننده يك زير واحد تنظيمي پروتئين فسفاتاز2A ترمريك شناسايي شد.(PP2A)‌، كه پيچش ريشه در پاسخ به NPA نشان مي دهد.(rcn1). جهش يافته rcn1 افزايش انتقال به پايين ريشه را كاهش پاسخ agravitropic و تاخير در تشكيل بيان ژن هاي القا شده تمايزي توسط اكسين در طي راس به ريشه تحريك شد توسط نيروي ثقل را نشان مي دهد، كه حالت تيمار NPA را به حالت نرمال برگرداند.
Michniewicz و همكارانش نشان دادند كه فعاليت PP2A كه RCN1 يكي از 3زير واحد تنظيمي در آرابيدوبسيس است(PP2AA) با عملكردPID روي PINs رقابت مي كند. از بين رفتن عملكرد PP2AA باعث همان تغيير جهت هاي از پايين به بالا در قطبيت PIN شد، منجر به نقص ريشه اي و جنيني مشابه مثل بيان زياد PID شد، در حاليكه جهش pid اين فتوتيپ ها بدون عملكرد pp2aa را مهار كرد.
PID و PP2AA اندازه اي با پروتئين هاي PIN روي غشاي پلاسمايي به صورت موضعي با هم قرار گرفته اند و در شرايط آزمايشگاهي و نيمه آزمايشگاهي سنجش هاي فسفريلاسيون نشان داد كه انها به صورت رقابتي روي وضعيت فسفريلاسيون پروتئين هاي PIN عمل مي كنند.
اين يك سوئيچ مولكولي است كه فسفريلاسون PIN توسط PID ، استقرار راسي اين حاملين كه جريان و به خارج اكسين را باعث مي شود را القا مي كند كه باعث PAT رو به بالا شود، در حاليكه PIN ها توسط PP2A اين وضعيت را وارونه مي كنند كه نهايتا باعث PAT رو به پايين مي شود.(تصوير5)

كمپلكس تنظيمي PID

چندين پروتئين تنظيمي PID در مخمر به عنوان برهمكنش دهنده ها با PID شناسايي شده است. دو تا از آنها PINOID BINDING PROTEIN1(PBP1) و TOUCH3(TCH3) هستند كه اتصال به PID وابسته به كلسيم است و به ترتيب فعاليت PID را در شرايط آزمايشگاهي توسعه و تنظيم مي كنند. هيچ يك از PBP1،TCH3 هدففسفريلاسيون PID نيستند و سنجش ها در جوانه هايي كه با مهار كنندهاي كالمودولين و ناقلين كلسيم تيمار شدند، افزايش در متلاشي شدن مريستم ريشه را نشان دادند.
بعلاوه، ما اطلاعات بيشتري به دست اورديم كه نقش تنظيمي PBP1 و TCH3 براي استقرار فرا سلولي و فعاليت كيناز PID را در شرايط ازمايشگاهي حمايت مي كردندو سومين بر همكنش كننده و تنظيم كننده PINOID Binding protein2 - PID است(PBP2) .
PBP2 حاوي 2 دومين برهمكنش دهنده پروتئين- پروتئين است، دومين BTB/POZ و TAZ دومين . PBP2قبلا به عنوان تنظيم كننده رونويسي متصل شونده به كالمودولين ATBT1شناخته شده بود.
مشاهدات ما پيشنهاد مي كند كه PBP2 به عنوان مهار كننده PID عمل مي كند، به طوريكه فعاليت خود فسفريلي شدن و انتقال فسفريلي شدن PID را در شرايط آزمايشگاهي مهار مي كند. علاوه بر اين پروتئين ادغام شده GFP-PBP2 در سلولهاي پياز استقرار شبيه به اسكلت سلولي را نشان مي دهد، كه پيشنهاد مي كند كه PBP2 اتصال احتمالي بين نقش استقرار يافته PID و اسكلت سلولي فراهم مي كند كه در تنظيم PAT نقش دارد.
همچنين استقرار سطح سلولي PBP2-GFP در پروتوپلاست هاي آرابيدوبسيس و گياهان بيشتر استقرار هسته اي و سيتوسولي را نسبت به استقرار اسكلت سلولي نشان داد.
مخمري2 موتورميكروتوبولي را به عنوان شريك هاي برهمكنش دهنده PBP2 به صورت نزديكي در ارتباط ديد كه PBP2 BINDING KINESIN1 و (PBK1,2) ناميده شدند آزمايشات شركتPBK ها را در مسير ترارساني علامت PID تاثير مي كند.
بر پايه اين مشاهدات ما فكر مي كنيم كه PBK ها همراه با PBP2 در فرايند مهار احتمالا تعيين محل استقرار سطح سلولي PID دخالت دارند.(تصوير5)


ديگر كينازهاي AGC دخيل در مراحل وابسته به اكسين

در آرابيدوبسيس PID متعلق به زير خانواده خاص VIII AGC از كينازها مي باشد. اعضا اين زير خانواده توالي هاي خاص را نشان مي دهد و اطلاعات عملكردي پيشنهاد مي كند كه آنها اورتولوگهاي گياهي PKA و PKC جانوري را ارائه مي كنند. آنها داراي خصوصيات ويژه اي هستند كه باعث تمايز آنها از همتاي جانوري آنها مي شود. براي مثال، موتيف DFG ظاهر شده در زير واحد VII دومين كاتاليزي كيناز با DFD جايگزين شده است. بعلاوه كينازهاي گروه AGC VIII يك توالي غير معمول 80-50 اسيد اسيدآمينه اي در لوپ فعال شونده در دومين كاتاليتيكي را نشان مي دهد. بر اساس صف بندي توالي پروتئين AGCكيناز آرابيدوبسيس در گروه قرار داد.
براساس ترتيب دومين كاتاليكي آنها ، معتقديم كه كيناز AGC III آرابيدوبسيس به 4زير گروه AtAGC1، تا 4 تقسيم مي شوند
جالب است كه اشاره كنيم كه در اين مقايسه جديد فوتو تروپين ها PHOT1 و PHOT2 (AtAGC4 ) بسيار مرتبط با PID هستند و كيناز هاي وابسته به (AtAGC3)PID شبيه PID ، كينازهاي وابسته به WAG1 PID و (AtAGC3) WAG2 و فتوتروپين ها همه در نمو گياه تنظيم شونده با اكسين دخيل هستند. د پائين درباره نقش اين كينازها در موج ريشه و پاسخ القا شده توسط نور آبي بحث مي شود.
فتو تروپين نور آبي يك جهته را به رشد فتوتروپيك تبديل مي كند.
فتوتروپين PHOT1 و 2 گيرنده هاي نور آبي هستند كه فرايند القا شده توسط نور آبي را مانند فتو تروپيسم جا به جايي كلرو پلاستها و باز شدن روزنه ها را كنترل مي كند. هر دو پروتئين عمل گسترده اي دارند، با PHOT1 تحت تمام وضعيت سرعت نوري فعال مي شود و PHOT2 به طور ويژه اي تحت وضعيت سرعت بالاي fluence عمل مي كند. PHOT1 و 2 شامل دومين درك كننده نور ، در بر گيرنده موتيف هاي 2 نور، اكسيژن يا ولتاژ (LOV) است كه به صورت غير كووالاني به مولكولهاي حساس به نور آبي فلاويين منو نوكلئوتيد و دومين سرين /ترئونين كيناز متصل است. مكانيزم مولكولي عمل فتو تروپين تا حدي روشن شده است.
فتوتروپين ها پروتئين هاي متصل به غشا هستند و در تاريكي دومين كينازي از طريق اتصال دومين گيرنده نوري مهار مي شود. نور تغيير كنفورماسيوني را در گيرنده نوري القا مي كند كه فعاليت پروتئين كينازي آن را فعال مي كند و در همان زمان كيناز از غشا پلاسمايي رها مي شود.
پروتئين هاي داراي دومين
(NPH3) nonphototropic hypocotyl3 BTB/POZ
و فتو تروپيسم ريشه 2(RPT2) تركيبات اضافي هستند كه در ترارساني علامت فتوتروپيسم نشان داده شدند و بعلت ساختار دومين شان ، معتقدند كه بر همكنش هاي پروتئين- پروتئين را تنظيم مي كند.
PHOT1،NPH3 ،RPT2 همگي وابسته به غشا پلاسمايي هستند و مي توانند به يكديگر متصل شوند.

تصوي5-مسير ترارساني علامت در هيپوكوتيل آرابيدوبسيس تاليانا همراه با مسير انتقال قطبي اكسين ، تنظيم شونده با مسير PDK1/PID و ABP1

• Plant Physiology
• Phytohormone
• فیزیولوژی گیاهی
• هورمون گیاهی